液相色譜法分析植物組織多胺含量

多胺是植物體內(nèi)的具有生理活性的一類有機(jī)小分子物質(zhì)，主要有腐胺（putrecine,put）、尸胺（cadecine,cad）、亞精胺（spermidine,spd）與精胺（spermine,spm）。它們與植物的生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系密切，參與植物細(xì)胞分裂、DNA的凝聚及激素的調(diào)控[1]等。在環(huán)境脅迫下，植物體內(nèi)大量的積累多胺類物質(zhì)，在穩(wěn)定細(xì)胞膜、核酸及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的構(gòu)象有重要的作用。多胺在人體內(nèi)也大量存在，并與人類健康息息相關(guān)[2] 。飲食是人體內(nèi)多胺的重要來(lái)源之一[3]，準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)植物組織中的多胺越來(lái)越受重視。

    由于多胺屬脂肪族直鏈胺類，以前主要用氨基酸分析儀、紙電泳等方法測(cè)定[4]，不僅樣品回收率低而且檢測(cè)靈敏度也不高。目前多用衍生化的方法，將多胺的一、二級(jí)氨基接上熒光或紫外有吸收的基團(tuán)，通過(guò)薄層或液相色譜分離檢測(cè)，常用的衍生試劑有丹磺酰氯、苯甲酰氯、苯磺酰氯及熒光胺類等[4~8]。

    自從1972年Redmond和Tseng [5]采用苯甲酰化的方法以來(lái)，色譜工作者對(duì)該方法進(jìn)行了不斷的改進(jìn)，已經(jīng)成為較為成熟的檢測(cè)植物體內(nèi)多胺的方法。然而在許多細(xì)節(jié)方面，如反應(yīng)的時(shí)間、副反應(yīng)的干擾、樣品的保存及分離條件的進(jìn)一步優(yōu)化等還有很多工作要做。

    實(shí)驗(yàn)部分

2. 1 儀器和試劑 Waters 515泵，2487雙波長(zhǎng)紫外/可見檢測(cè)器。腐胺、亞精胺為Fluka產(chǎn)品，精胺為Sigma產(chǎn)品，甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2. 2 色譜條件 色譜柱：NovapakC18柱（Waters,150×3.9mm,4um）。 流動(dòng)相：甲醇：水（60：40，v/v），檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，流速0.7ml/min，柱溫30℃，Breeze色譜工作軟件。

2. 3 材料處理 1.0~2.0g，加入4ml 預(yù)冷的5%高氯酸（v/v）冰浴研磨，冰浴浸提1小時(shí)后離心（15，000g，30分鐘，4℃）。取上清500ul加入10ml 帶蓋塑料離心管，加入7ul苯甲酰氯，再加入1ml 2M NaOH，渦漩20s后在37℃水浴反應(yīng)20min。加入2ml 飽和NaCl溶液，混勻后用2ml 乙醚萃取，取1ml 醚相真空干燥，用100ul甲醇渦旋后過(guò)0.45um 的濾膜，取10ul進(jìn)樣。

2. 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 標(biāo)準(zhǔn)品配成1mmol/L濃度的貯液，各取40ul按2.3的方法進(jìn)行苯甲酰化。分別取苯甲酰化后的多胺標(biāo)準(zhǔn)液0.03，0.06、0.12、0.25、0.50、0.75、1.0nm/10ul進(jìn)樣，以面積對(duì)進(jìn)樣量作曲線。

參考文獻(xiàn)

1 趙福庚，劉友良.高等植物體內(nèi)特殊形態(tài)多胺的代謝及調(diào)節(jié).植物生理學(xué)通訊，2000，36（1）：1~5
2 Tiburcio A F, Altabella T, Flores D et al. Manipulation of polyamines in food plants:chemical
and transgenic approaches,In :Bardóce S,White A（eds）.Polyamines in Health and Nutrition. Klvwer Academic Publishers.1999,161~176
3 吉曉佳，劉友良.植物源食品多胺的作用及其調(diào)控.植物學(xué)通報(bào)（印刷中）
4 Nikolaus S.Thin-layer chromatography and thin-layer electrophoresis of polyamines and their
derivatives,In:Tabor H,Tabor CW（eds）. Polyamines.New York:Academic Press,1983,3~9
5 Redmond JW and Tseng A.High-press liquid chromatographic determination of putrescine,cadaverine,spermidine and spermine .J of chromatography.1979,170 ,479- 481.
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8 杜軍英，孫秉庸，陳兆珍等.OPA—巰基乙醇柱前衍生反相液相色譜法測(cè)定生物組織中多胺含量.解放軍高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，1997，（1）：53